Die Schlosskirche von Hohentübingen wurde bereits 1188 als „Capella Twingen“ urkundlich erwähnt und ist damit die älteste der noch vorhandenen Tübinger Kirchen. Die Bogenfenster dieses ersten Kirchenraumes sind heute noch im Nordflügel des Schlosses erkennbar. Dem heiligen Johannes geweiht, diente sie den Pfalzgrafen von Tübingen als Bet- und Beichtstätte. Der spätere Schlossherr, Graf Eberhard im Barte erwirkte bei Papst Sixtus IV. die Erhebung der Kapelle zur Pfarrkirche, da ihm und seinem Gefolge der Gottesdienstbesuch in der Stiftskirche allzu „beschwerlich und bei Nacht gefährlich“ war. 1516 wurde sie allerdings bereits wieder zur Filialkirche herabgestuft. Bei den großen Schlossumbauten im 16. Jahrhundert unter Herzog Ulrich errichtete man die Schlosskapelle an ihrem heutigen Standort im Südflügel völlig neu und als deutliche Reminiszenz auf die nun evangelische Konfession des Herrscherhauses. Doch bei der französischen Belagerung des Schlosses Ende des 30jährigen Krieges wurde sie 1647 so schwer beschädigt, dass eine aufwändige Renovierung nötig wurde.

Seitdem das gesamte Schloss im Jahr 1816 vom württembergischen König Wilhelm I. der Universität überlassen wurde, dient die Schlosskirche mit Sakristei als Sitz der Evangelischen Predigeranstalt. So erlangen seit über 200 Jahren Theologiestudierende in diesen Räumen einen Teil ihrer praktisch-theologischen Bildung.

Der schlichte Rechteckbau beeindruckt mit seiner historischen Holzdecke aus dem 17. Jahrhundert. Die Ausstattung, insbesondere die Illusionsmalerei an den Wänden und der Altar, stammen aus dem 19. Jahrhundert und haben neogotischen Charakter.